Představujeme výsledky projektu NAZV QJ1210047
Vývoj nových prostředků pro podporu imunity včel, prevenci a léčbu včelích onemocnění (2012-2016)
V projektu jsou zapojeny tři spoluřešitelské organizace, Výzkumný ústav včelařský, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity a Česká zemědělská univerzita.
Mikrobiota může hluboce zasahovat do našeho zdraví, což ukazují pokusy na obézních myších. Těm, kterým byly do střeva podány mikroorganismy zdravých jedinců, se hmotnost a cholesterol upravily k normálu, a naopak, mikroflora obézních jedinců navodila u zdravých myší obezitu. Podobně zásadní význam má i mikroflora na zdraví včel a tomuto tématu se věnují týmy z Yale University v USA, Univerzita ve Švédsku a mimo jiné ve spolupráci s VÚV i Česká zemědělská a Masarykova univerzita za grantové podpory MZe ČR.
V rámci společného projektu se oba týmy zabývají vlivem mikroorganismů a přírodní látky sangvinarinu na zdraví včel, indikátory stresu a výnos včelstva. Cílem je pochopit vztahy včel a mikroorganismů, definovat nové spolehlivé biochemické markery stresu včel a vyvinout prostředek, který na základě vědeckých podkladů zvýší šance včelstev odolat nákaze moru včelího plodu v oblastech s vyšším tlakem.
Probiotika - zajímavý koncept s otazníky
Probiotika se stala fenoménem funkčních potravin a veterinárních přípravků posledních dvaceti let. Na trhu se již objevují probiotika pro včely, přitom ale dosud chybí znalosti o přirozené dynamice mikroflory trávicího traktu včel v průběhu vývoje larev i stárnutí dospělců. Probiotika jsou mikroorganismy, které mají po požití přínos pro svého hostitele. Trávicí trakt včel je plný mikroorganismů, které vykonávají řadu důležitých metabolických funkcí: štěpí cukry, lipidy, zásobují hostitele vitamíny skupiny B (referovali jsme ve Včelarství číslo 1/2014). Tato křehká rovnováha se ale za určitých podmínek stresu, například nákazy, může rozkolísat.
Dynamika přirozené mikroflory
Provedli jsme rozsáhlý rozbor mikroflory trávicího traktu všech vývojových stádií včel analýzou 16S genu metodou DGGE.
Obrázek: Vývojové stádia Apis mellifera (jednodenní, třídenní a šestidenní larva, kukla bílá, kukla černá, mladuška, trubec, včela létavka); foto: Jaroslav Havlík, Ondrej Hronec.
Experiment probíhal ve třech lokalitách ve Středočeském kraji a jižních Čechách, vždy u třech včelstev na každém stanovišti.
Zjistili jsme hlavní trendy, kterými mikrobiom v průběhu vývoje včely prochází. U nejmenších stádií převládají Gammaproteobakterie, u starších larev můžeme pozorovat vyšší zastoupení laktobacilů.
Obrázek: Heatmap zobrazující relativní hustotu vybraných dominantních bandů z gelu denaturační elektroforézy v barevném spektru. Vzorky jsou řazeny podle vývojového stádia (1, 3 a 6 denní larvy (L1, L3, L6), bílé a černé kukly (PW, PB), mladušky, létavky a trubce (BY, BF, DR)) v rámci 4 stanovišť.
Překvapením byla obrovská rozmanitost mikroflory v rámci stanoviště. Nejen jednotlivé úly, ale i jedinci v rámci úlu se liší. V trávicím traktu jedinců náhodně dominují některé bakteriální kmeny v relativně vysokých počtech. Variabilita je tak velká, že jsme s pomocí našich metod nezjistili žádné markantní podobnosti mezi úly na jednom stanovišti, vs. mezi stanovišti. Nepotvrdilo se nám, že by stanoviště a tedy podobná pastva nebo způsob včelaření nějak určovaly složení mikroflory.
Snůšku probiotika nezvýšila, imunitu zřejmě ano
Na základě studia přirozené mikroflory jsme izolovali a namnožili z našeho pohledu nejvýznamnější kmeny a zjišťovali, jaký vliv má jejich podávání na pokusná včelstva Výzkumného ústavu včelařského. Suspenzi jednotlivých kmenů: Lactobacillus apis, Lactobacillus melliventris, Gilliamella apicola a jejich směsi jsme rozprašovačem aplikovali na rámky ve středu plodiště. Každý kmen nebo směs jsme aplikovali ve třech úlech, na jednom stanovišti, avšak nesousedících. Vzorky třídenních a šestidenních larev, bílých kukel a dospělců jsme odebírali několik týdnů před aplikací a 42 dní po ní.
Poté jsme z trávicích traktů vzorků všech stádií izolovali a analyzovali DNA a stejné vzorky jsme odebrali i pro biochemické analýzy hemolymfy. Mimo to byly úly i váženy za účelem vyhodnocení výnosu. Vážení ukázalo, že u všech včelstev s administrací kteréhokoliv mikroorganismu, včetně jejich směsi, byl pozorován pozitivní trend a nárůst čisté hmotnosti o 8 %, který nevylučuje, že by přídavek probiotik mohl mít pozitivní vliv i při běžné aplikaci u bezproblémových včelstev. Na konci tohoto roku budeme mít kompletní výsledky biochemických a molekulárně-biologických testů, zatím víme pouze, že probiotika neovlivňovala antioxidační parametry. Přípravek na bázi probiotik by tak nalezl uplatnění u včelstev v horší kondici nebo u těch, které jsou vystaveny infekčnímu tlaku moru.
Sangvinarin je dobře snášen
Sangvinarin, nebo lépe jeho koncentrovaný zdroj, extrakt okecku srdčitého, je velmi perspektivní látkou se schopností selektivní aktivitou modulovat složení mikroflory, potlačováním oportunních patogenů. Provedli jsme pokus s podáváním 40% sangvinarinu v medocukrovém těstě na horní loučky rámků v pokusných včelstvech.
Obrázek: Srovnání stavu příjmu kontrolního medocukrového těsta (vpravo) a těsta s obsahem extraktu se sangvinarinem 1 g/kg (vlevo) týden po administraci.
Administrace sangvinarinu 1 g/kg těsta byla včelami velmi dobře snášena a úly, kde byl podáván, subjektivně vykazovaly lepší stav. Tyto výsledky jsou zatím velmi předběžné, protože variabilita hmotnostních přírůstků mezi včelstvy byla velmi vysoká a opět, trend není statisticky průkazný.
Imunita souvisí s antimikrobiální aktivitou hemolymfy
Jedním z dalších cílů projektu, kterému se věnuje tým z Masarykovy univerzity v Brně, je vliv zmíněných dvou produktů na antimikrobiální aktivitu včelí hemolymfy.
Tento imunitní parametr je velmi zajímavý, jelikož dobře odráží schopnost včel odolávat bakteriálním infekcím a navíc se u nich přítomné antimikrobiální látky podílejí také na obraně proti jiným patogenům (mikroskopickým houbám, prvokům i parazitům). Mezi látky s antimikrobiálními účinky patří u včel především peptidy volně přítomné v hemolymfě (např. apidaecin, abaecin, mellitin nebo lysozym). Při validaci této metody narážíme na úskalí, totiž, že antimikrobiální aktivita hemolymfy včel je výrazně nižší, než u jiných druhů. Je vidět, že včely evolučně investovaly do rozvoje imunity sociální a jiných způsobů boje s infekcí (o imunitě včel jsme referovali ve Včelarství číslo 9/2015).
Pokusná nákaza entomopatogenními hlísticemi
MU v Brně vyvíjí a validuje další metodu na objektivní posouzení imunitního stavu včel a tou je přežití laboratorní nákazy entomopatogenními hlísticemi Heterorhabditis bacteriophora a Steinernema feltiae. Jedná se o přirozenou nákazu hlísticemi, které slouží jako vektor pro jejich symbiotické bakterie rodu Photorhabdus a Xenorhabdus.
Obrázek: Včelí plod a kukly po nákaze entomopatogenními hlísticemi Heterorhabditis bacteriophora. Úspěšná nákaza se projeví změnou barvy, nenakažený plod zůstává bílý.
Tyto organismy jsou přirozenými nepřáteli hmyzu, jsou používány např. k biologické kontrole škůdců a jejich schopnost nakazit a zabít hostitele je závislá na efektivitě imunity hmyzího hostitele. Zjistili jsme, že entomopatogenní hlístice jsou schopny infikovat a vyvíjet se také na nesegmentovaném plodu včel za laboratorních podmínek, v úlech hlístice nakazit plod ani dospělce nemohou.
Obrázek: Imunostimulační účinek sangvinarinu a mixu nepatogenních bakterií (Lactobacillus apis, Lactobacillus melliventris, Gilliamella apicola) na larvy infikovány Steinernema feltiae. (* = P <0,01, ** = P <0,05).
Výsledky mortality po 48 hodinách od aplikace sangvinarinu nebo probiotik ukazují na významný protektivní účinek obou přípravků, kdy došlo k lepšímu přežívání po experimentální nákaze hlísticemi, což by znamenalo, že má pozitivní účinek na imunitu včel.
Shrnutí
Během trvání projektu bylo dosaženo řady povzbudivých výsledků, které byly vzhledem k novosti a významnosti prezentovány na zahraničních konferencích (EurBee6 Murcia 2014, Apimondia Kyiv 2013 a Daejeon 2015, SIP Tours 2016) a publikovány ve významných zahraničních časopisech (PloS ONE, European Journal of Entomology, Scientia Agriculturae Bohemica, Bulletin of Insectology). Jako součást projektu bylo také vyvinuto provozní zařízení pro výrobu Masamarilu.
Vše nyní směřuje k vývoji přípravku, který bude využitelný pro prevenci nákazy u včel, které jsou vystaveny vyššímu tlaku moru včelího plodu. Tento produkt bude mít přesný mechanismus účinku, bude vyvinut na základě vědeckých podkladů a znalosti dynamiky včelí mikroflory. Projekt přispívá k rozvoji nových metod na stanovení imunitních markerů včel.
