Nukleární magnetická rezonance a její aplikace v zemědělství a potravinářství

Spektroskopie nukleární magnetické rezonance, NMR, je unikátní metoda pro chemickou analýzu. Je známa zejména jako metoda využívaná pro strukturní analýzu molekul, méně známé je její použití pro kvantifikaci sloučenin ve směsích.

NMR 500 MHz na katedře Kvality a bezpečnosti potravin

Metoda je založena na absorpci radiofrekvenčního elektromagnetického záření jádry některých atomů v molekulách analyzovaných vzorků umístěných v magnetickém poli, u nás nejčastěji vodík 1H a uhlík 13C. Pro kvantifikaci látek ve směsích se využívá nejčastěji 1H. Jádra vodíků v závislosti na svém okolí, přítomnosti jiných jader jsou v magnetickém poli různou mírou stíněny orbitující elektrony. Toto stínění vede k posunu vyzařované frekvence a posunu ve spektru. Zcela odstíněná jádra se objevují ve spektru více vlevo než jádra stíněná, která jsou např. součástí alifatických uhlíkových vazeb, ta mají posun menší nebo žádný, tedy blíže hodnoty 0. 

V praxi se vzorek se převede do kapalného stavu, odstraní se pevné částice a umístí se do NMR zkumavky. Po zhruba 20 minutové analýze je získáno spektrum s dobře rozlišenými odezvami jednotlivých vodíků v různých molekulách. Každá molekula tak dává několik signálů ve spektru, každý jednotlivý proton se objevuje na ose x udávající tzv. chemický posun, více vlevo nebo více doprava (mezi 0 a 8 ppm). Osa je v jednotkách udávajících relativní posun v miliontinách k absolutní frekvenci magnetu, v našem případě 500 MHz. Intenzita signálu udává, kolik jader je v podobném prostředí. Ve složitých směsích se jádra mnoha molekul mohou překrývat. Kromě toho jsou píky signálu rozštěpeny do multipletu je způsobeno spinovou interakcí se sousedídími protony. Charakteristický tvar píku napomáhá jednoznačnému určení překrývajících se signálů.

Ukázka 1H NMR spektra lidské stolice, vybrané izolované píky jsou popsány, spektrum je kvůli přehlednosti rozděleno na dvě části s rozdílným zvětšením. Horní obsahuje zejména signály cukrů, SCFA a aminokyselin, spodní fenolové sloučeniny a puriny.

Získaná spektra se mohou zpracovávat dojím způsobem - buď se k nim přistoupí jako k profilu a s pomocí vícerozměrné statistiky, ANOVA nebo párových testů se vyhodnotí píky, které jsou významně rozdílné mezi kontrolou a ošetřením. Druhou možností je přímo kvantifikace sloučeniny ve spektrech, podle intenzit píků. Zde se používá např. software Chenomx. Výhodou NMR je, že odezvy signálů jsou absolutní a pro kvantifikaci známých látek není potřeba standardů nebo kalibračních křivek.

Nevýhodou NMR je nižší citlivost, zachytí obykle jen analyty zastoupené v koncentraci vyšší než 20-100 mcg/mL. Výhodou je ale robustnost, absolutní kvantifikace, a možnost určení neznámé struktury. Příkladem využití NMR v analýze je např. Analýza cukrů nebo organických kyselin v ovoci. Složení aminokyselin v mase, stanovení rozmarinové kyseliny v rozmarínu, kofeinu v kávě, kvercetinu v cibuli, isoflavonoidy v sóji, apod. 

V následujících odstavcích představujeme některé naše projekty, možnosti a prostředky NMR analýzy.

Kontrola falšování mléka s pomocí NMR

Kozí mléko je oblíbenou alternativou k mléku kravskému s možnými zdravotními benefity. Vzhledem k vyšší ceně je často falšováno mlékem kravským. S pomocí NMR lze v mléku kvantifikovat 52 a více sloučenin. Na základě necílové vícerozměrné statistiky lze kravské mléko od kozího dobře rozpoznat. V rámci projektu ministerstva zemědělství jsme vyvinuli metodu, která je schopna s pomocí NMR detekovat falšování mléka na základě přítomnosti signálu N-glukosaminů, a to s vysokou přesností. Rysova et al. (2021)

Analýza hlavních komponent a diskriminační analýza nejmenších čtverců vzorků kozího a kravského mléka ukazuje významné rozdíly mezi nimi. Níže ukázaný loadingsplot ukazuje nejvýznamnější peaky ve spektru, intenzita barvy ukazuje významnost v diskriminaci.

Metabolismus polyfenolů v tlustém střevě člověka

Polyfenoly hrají významnou roli jako antioxidanty v naší stravě. Mají pozitivní vliv na kardiovaskulární zdraví. Ukazuje se ale, že aktivní formy těchto látek, účinné v organismu, vznikají až působením bakterií v tlustém střevě. V in vitro podmínkách jsme nasimulovali fermentační procesy probíhající v lidském tlustém střevě, v malých ampulích s médiem zaočkovaných lidskou stolicí. Tyto ampule mimo jiné obsahovaly malé koncentrace různých polyfenolů, antioxidantů z ovoce a zeleniny. Po 24h byly obsahy ampulí analyzovány s pomocí LC-MS, NMR a sekvenace příští generace na zařízení Illumina, za účelem zjistit, jak přítomnost polyfenolů ovlivnila střevní fermentační pochody a jaké metabolity z látek vznikaly. Zjistili jsme, že polyfenoly byly rychle metabolizovány na jiné sloučeniny, u seniorů ale toto probíhalo pomaleji. Některé polyfenoly např. silymarin zpomalovaly fermentaci, využití cukrů a měly za následek malou změnu ve složení mikroorganismů.

Ferulová kyselina byla v in vitro modelu tlustého střeva metabolizována na několik sloučenin. Hlavním produktem byla 3,4 dihydroxyfenyloctová kyselina, která byla dále metabolizována za vzniku 3,4-dihydroxyhydroskořicové kyseliny. Ferulová kyseliny je jedním z hlavních dietárních antioxidantů, přijímáme ji hlavně z kávy a obilovin. Všechny metabolity reakce byly kvantifikovány s pomocí NMR.

Určení odrůdy, původu a senzorických vlastností vína s pomocí NMR

Česká republika má díky tradici, historickým okolnostem a terroir velmi pestrou paletu vín, zajímavou a jedinečnou. V posledních letech se kvalita vína výrazně zvedla, k čemuž přispěla i přísnejší legislativ a důsledná kontrola původu. Salon vín České republiky představuje kolekci 100 nejlepších moravských a českých vín, která uspěla v konkurenci téměř 2400 vín. Navázali jsme se Salónem vín spolupráci a vytváříme databízi 1HNMR profilů spekter vín. Tao spektra nesou informaci o koncentracích cukrů, organických kyselin, aminokyselin, alkoholů, a mnoha dalších. S pomocí metod strojového učení je možné na základě spekter určit cukernatost, obsah alkoholu, ale i pravděpodobnou odrůdu nebo oblast, odkud víno pochází v rámci ČR. Výsledky analýzy jsme pulikovali v časopise Food Chemistry (Mascellani et al., 2001).

Ukázka 1H NMR spektra vína, identifikovaných metabolitů a klastrové analýzy, která vyjadřuje podobnost spekter vzorků. Zajímavé je, že jako podobné jsou charakterizovány ty vzorky, které jsou zároveň geneticky příbuzné.

Využití NMR ve včelí biologii

Studium biologie a biochemie včel má velký hospodářský a environmentální dopad. Chované včely Apis mellifera jsou nejvyznamnějšími opylovači plodin současného intenzivního zemědělství. Bez jejich příspění by z našeho jídelníčku téměř všechno ovoce nebo zelenina. Zdraví včel je tedy logicky velmi sledovaným faktorem. S pomocí NMR lze ve včelích organismech sledovat kolem 50-60 sloučenin. 1H NMR tak nabízí zcela novou metodu schopnou sledovat některé fyziologicky významné periody včelího vývoje, například diagnostikovat připravenost včelstev na zimu, sledovat biochemické změny v období snůšky, stres z patogenů, rojení apod. NMR má potenciál zjistit proč jsou některá včelstva náchylnější k nemocem než jiná.

Včely v tzv. klíckovém pokusu, kde jim je podávána různá experimentální strava. Později jsou včely usmrceny, zbaveny trávicího traktu, homogenizovány a analyzovány s pomocí NMR.

Včelí homogenáty jsou natolik rozdílné v jednotlivých měsící, že jsme například schopni diagnostikovat ve kterém měsíci byly včely odebrány. Obrázek níže ukazuje jako příklad Analýzu hlavních komponent včel odebraných na podzim a v létě.

PCA skupiny včel odebraných v létě a na podzim ukazuje, že na podzim se líhnoucí včely méně větvených aminokyselin a volnného cholinu, ale více cukrů, TMAO nebo NAD+

NMR v analýze rezistence gerber proti padlí

Gerbery jsou mezi světově nejoblíbenějšími řezanými kvetinami. Obchod s květinami je pro Nizozemsko velmi významný, ročně se exportují květiny v objemu deset miliard EUR. Pěstování okrasných květin je ovšem spojeno s masivním používáním hnojiv a pesticidů, za což sklízí velkou kritiku. Pěstitelé mají zájem na výzkumu mechanismů rezistence proti padlí, jednomu ze nejvážnějších fytopatogenů, případně o nástroj, který by pomohl diagnostikovat rezistentní šlechtěnce ve stádiu sadby. 

Nabídka gerber firmy Schreurs, NL, https://www.schreursgerbera.com/products

Od našeho partnera z Wageningen University, Dr. Kirsten Leiss, jsme měli k dispozic dvě sady listů rezistentních i nerezistentních odrůd. Naměřili jsme 1H NMR spektra extraktů a jejich srovnáním zjistili v čem se tato spektra liší. Rezistentní odrůdy obsahovaly více laktonů sorbové kyseliny, fytochemikálií známých pro inhibiční účinky proti houbám. Podrobná analýza spekter umožnila jasně určit i strukturu metabolitů, jeden z nich je dokonce dosud neznámá sloučenina.

PCA a OPLS-DA analýza rozdílů homogenýtů včel odebraných v létě a na podzim

NMR analýza biologických tekutin v klinické diagnostice

Spolupracujeme s University of Glasgow, 2. lékařskou fakultou FN Motol a kohortami COPSAC, MIDIA, klinickými studiemi, např. PREVAIL, a to v rámci H2020 projektu HEDIMED, kde jsme členem konzorcia. Pracujeme na projektech výzkumu možného mikrobiálního původu Crohnovy choroby, vlivu léčebné výživy u IBD, výzkumu faktorů podílejících se na rozvoji celiakie. Ve všech těchto projektech figurujeme jako pracoviště zaměřené na NMR diagnostiku klinických tekutin. Specializujeme se především na metabolomiku stolice.

Proč je důležité analyzovat složení stolice? Stolice je jednak odrazem naší stravy, ale i mikrobiálního osídlení trávicího traktu. Mnoho onemocnění je způsobenou dysbiózou mikrobů ve střevě, nebo k dysbióze vede. Dysbiotická mikrobiota může v tlustém střevě například produkovat toxické látky, jako jsou biogenní aminy: např. putrescin, kadaverin, trimethylamin oxid, které pak mohou vstupovat do organismu a ovlivňovat zdraví.

Statistické srovnání NMR profilu stolice dětí na bezmléčné a mléčné dietě ukazuje vyšší zastoupení signálů cukrů v rozmezní 5-5.5 ppm, které je také statisticky významné.

NMR trusu primátů

Ve spolupráci s Ústavem biologie obratlovců a University of Minnesota pracujeme na analýze stolice goril nížinných. Gorily jsou příbuzné člověku závěry výzkumu jejich výživy jsou do značné míry přenositelné na člověka. Gorily, přestože jsou vegany, trpí v zajetí často onemocněním diabetes. Jejich mikrobiom v zajetí a ve volné přírodě je jiný, spekuluje se tedy o možné kauzální příčině v souvislosti s mikrobiomem.

1H NMR Metabolom stolice volně žijících goril je velmi rozdílný v období sucha  a období dešťů. Oproti tomu gorily ze ZOO maji stolici zcela jinou, jak je vidět z PCA analýzy. To je zřejmě dáno stravou a mikrobiotou. Volně žijící gorily mají ve stravě více vlákniny a fenolových sloučenin. Na obrázku vpravo jsou obrazové body vysvětleny podle původu vzorků. Ukazuje se zajímavý fakt, že metabolom goril z pražské ZOO je ale těm divoce žijícím velmi podobný.

  Gorily s diagnostikovaným diabetes mellitus vykazují ve stolici průkazně méně některých aminokyselin, celkově ale jsou si profily dost podobné